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rTEV蛋白酶公司正在出售的產(chǎn)品:MEF抗性的小鼠胚胎成纖維細胞,經(jīng)射線(xiàn)處理,P3,300萬(wàn)細胞 鈣調節/鈣調蛋白/鈣調封閉多肽 棒桿菌通用PCR檢測試劑盒 大鼠(CA)ELISA Kit 性木聚糖活性比色法檢測試劑盒/性半纖維活性比色法檢測試劑盒 小紅卵菌 晶狀體蛋白2抗體
更新時(shí)間:2024-01-14
公司產(chǎn)品僅供科研研究使用、不得用于臨床診斷!
貨號 | 產(chǎn)品名稱(chēng) | 規格 |
A-PJ1111 | rTEV蛋白酶 | 1000U |
rTEV 蛋白酶(重組型)是經(jīng)過(guò)基因工程改造后的重組蛋白酶,該酶特異性識別 Glu-Asn- Leu-Tyr -Phe-Gln-Gly七氨基酸序列,并高特異性、高活性剪切(剪切位點(diǎn)在Gln-Gly之間)。該酶經(jīng) 6×His 標簽純化而得(含組氨標簽),純度達99%,剪切反應完畢后可通過(guò) Ni-NTA Resin )去除。該酶在 4℃-30℃溫度、pH 范圍(6.0-8.5)反應條件下均具有活性(見(jiàn)下表)。
活性定義:在 1×rTEV Buffer(50 mM,pH8.0, 0.5 mM EDTA,1mM DTT),30℃反應 1h,剪切>85%的 3 μg 底物所需要的酶量定義為一個(gè)活性單位。
應用:融合蛋白標簽剪切去除。
儲存:長(cháng)期儲存-70℃,可儲存 2 年,-20℃可儲存 6 個(gè)月。
操作方法
1. 在 EP 管中配制如下反應體系
融合蛋白 20 μg
20×rTEV Buffer 7.5 μl
0.1M DTT 1.5 μl
rTEV Protease 1-3 μl
ddH20 Up to 150 μl
2. 30℃孵育,在 1、2、4、6 小時(shí)分別吸出 30 μl 上述反應液,置于單獨的 EP 管中。
3. 向上述 EP 管中加入 30 μl 2×SDS Loading Buffer,置于-20℃。
4. 樣品全部反應完畢后,樣品煮沸 5 min,取 40 μl 進(jìn)行SDS-PAGE 分析。
5. 如融合蛋白要求低溫處理,可將反應液置于 4℃,請延長(cháng)反應時(shí)間,并增加 rTEV 酶用量。
PCR 反應需要使用哪些試劑和設備?
試劑:
模板DNA:PCR反應需要模板DNA,如從細胞、組織、血液中提取DNA等;引物:PCR反應的兩個(gè)引物,分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區域,引物也可以合成為T(mén)A克隆等過(guò)程中使用到的引物;dNTPs:PCR反應中需要四種dNTPs,包括脫氧腺苷酸(dATP)、脫氧胸苷酸(dCTP)、脫氧鳥(niǎo)苷酸(dGTP)、脫氧胞嘧啶酸(dTTP),用于細胞分裂、DNA合成等生物學(xué)過(guò)程,用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增;Taq DNA聚合酶:PCR反應需要的聚合酶,一般使用Taq聚合酶,還有一些其他種類(lèi)的聚合酶如PFU、Phusion等,用于擴增DNA鏈;PCR buffer溶液:對PCR反應具有緩沖作用,調節反應pH,硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛,可增強PCR反應特異性,從而提高反應效率;酶切體系:PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實(shí)驗步驟,常常需要進(jìn)行酶切操作。MARK:一種分子量標準,用來(lái)判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒:用于純化PCR反應產(chǎn)物;
設備:
PCR儀:用于控制反應溫度,保證PCR反應時(shí)不同溫度環(huán)節的嚴格控制;電泳槽:用于分離PCR擴增產(chǎn)物;核酸提取儀:從組織樣本中全自動(dòng)提取核酸。 這些試劑和設備在PCR分子生物學(xué)技術(shù)中均是,只有在有序齊全的基礎上,才能進(jìn)行PCR反應并得出準確結果。
PCR相關(guān)基礎實(shí)驗:
PCR反應基本步驟一般的聚合酶鏈式反應由20到35個(gè)循環(huán)組成,每個(gè)循環(huán)包括以下3個(gè)步驟:
一、變性:
利用高溫(93-98℃)使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個(gè)循環(huán)之前,通常加熱長(cháng)一些時(shí)間以確保模板和引物分離,僅以單鏈形式存在。該步驟時(shí)間1-2分鐘,接下來(lái)PCR儀就控制溫度進(jìn)入循環(huán)階段。
二、退火或稱(chēng)接合,復性:
在DNA雙鏈分離后,降低溫度使得引物可以結合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點(diǎn)5℃。錯誤的退火溫度可能導致引物不與模板結合或者錯誤地結合。該步驟時(shí)間1-2分鐘。
三、延伸:
DNA聚合酶由降溫時(shí)結合上的引物開(kāi)始沿著(zhù)DNA鏈合成互補鏈。此階段的溫度依賴(lài)于DNA聚合酶。該步驟時(shí)間依賴(lài)于聚合酶以及需要合成的DNA片段長(cháng)度。傳統的Taq估計合成1000bp/min、較新的Tbr(來(lái)自于嗜熱菌Thermus brockianus)約40秒、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15秒。
PCR反應條件優(yōu)化:
1、變性溫度和時(shí)間:
保證模板DNA解鏈是保證整個(gè)PCR擴增成功的關(guān)鍵。加熱90~95°C, 30~60s,再復雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過(guò)高或高溫持續時(shí)間過(guò)長(cháng),可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。
2、復性溫度和時(shí)間:
PCR擴增特異性取決于復性過(guò)程中引物與模板的結合。復性溫度越高,產(chǎn)物特異性越高。復性溫度越低,產(chǎn)物特異性越低。需根據引物的Tm值具體設定。
3、延伸溫度和時(shí)間:
一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個(gè)核苷酸時(shí),過(guò)高的延伸溫度不利于引物與模板的結合,可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應時(shí)間,可根據待擴增片段的長(cháng)度而定,小于1kb, 1min足夠;大于1kb需加長(cháng)延伸時(shí)間。Taq酶可根據1kb/min增加時(shí)間。這里需要注意,延伸時(shí)間過(guò)長(cháng)可能出現非特異擴增。因此需要設置恰到好處的延伸時(shí)間。
4、循環(huán)數:
其他參數選定后,PCR循環(huán)次數主要取決于模板DNA的濃度。理論上說(shuō)20?25次循環(huán)后,PCR產(chǎn)物的積累即可達到最大值,實(shí)際操作中由于每步反應的產(chǎn)率不可能達到100%,因此不管模板濃度是多少,20~30次是比較合理的循環(huán)次數。循環(huán)次數越多,非特異擴增增加。
公司正在出售的產(chǎn)品:
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平尾毛細線(xiàn)蟲(chóng)探針?lè )晒舛?/span>PCR試劑盒 | 二磷甘油變位ELISA試劑盒 | 禽傳染性支氣管炎病毒流行株染料法熒光定量RT-PCR試劑盒 |
貓瘟病毒(FPV)核檢測試劑盒 | 反式高爾基體網(wǎng)狀結構蛋白2ELISA試劑盒 | 藍氏賈第鞭毛蟲(chóng)型PCR檢測試劑盒 |
貓免疫缺陷病毒探針?lè )晒舛?/span>PCR試劑盒 | 芳犬尿氨甲酰胺ELISA試劑盒 | 諾氏瘧原蟲(chóng)PCR檢測試劑盒直銷(xiāo) |
帕臘南病毒PCR檢測試劑盒 | 分揀連接蛋白12ELISA試劑盒 | 馬杜拉放線(xiàn)菌PCR檢測試劑盒 |
流感嗜血桿菌PCR檢測試劑盒說(shuō)明書(shū) | 人7α-羥化(CYP7A)ELISA試劑盒 | 禽痘病毒探針?lè )晒舛?/span>PCR試劑盒 |
牛棒桿菌探針?lè )晒舛?/span>PCR試劑盒 | 人上皮特異性抗原(ESA)檢測試劑盒elisa | 犬血巴爾通體染料法熒光定量PCR試劑盒 |
鼠附紅細胞體(鼠嗜血支原體)探針?lè )晒舛?/span>PCR試劑盒 | rTEV蛋白酶人白細胞酯(LE)試劑盒ELISA | 莫氏立克次體探針?lè )晒舛?/span>PCR試劑盒 |
田鼠分枝桿菌探針?lè )晒舛?/span>PCR試劑盒 | 人β-微管蛋白(TUBB)ELISA Kit | 產(chǎn)腸毒性大腸桿菌探針?lè )晒舛?/span>PCR試劑盒 |
鹿源性成分(Deer)核檢測試劑盒 | 人催乳(PRL)試劑盒ELISA | 病毒H5N1亞型PCR檢測試劑盒 |