Super ECL Substrate

商品屬性：

超敏 ECL 顯色液用于 Western、Northern 和 Southernblot 分子雜交的化學(xué)發(fā)光檢測，比傳統化學(xué)顯色法靈敏度高，可達 pg 水平。原理是采用新型發(fā)光底物（Luminol），其與辣根過(guò)氧化物酶反應時(shí)產(chǎn)生很強的發(fā)光信號，在暗室中對X-光片感光，以此檢測微量蛋白而獲得理想的實(shí)驗結果。?；鰪娦?ECL 顯色液具有靈敏度高，持續時(shí)間長(cháng)等特點(diǎn)。

應用
在 Western 印跡分析，核酸雜交以及 EMSA 實(shí)驗中，HRP標記的二抗或探針與靶分子結合再與底物反應產(chǎn)生可見(jiàn)光。
儲存：2-8°C，Super ECL A 要求避光保存。
操作方法（以 Western Blot 為例)
1．按每平方厘米膜面積用 0.1-0.2 ml 配置顯色液：根據顯色液的需要量，取等體積 A 液和 B 液，混勻后避光保存備用；該顯色液必須現配現用。
2．2. 取出膜，平放在干凈的保鮮膜上，膜的正面（蛋白質(zhì)面）朝上，在膜的中央加適量的配置好的顯色液（6×8 cm 的膜加 2 ml 顯色液），溶液向四周迅速擴散，覆蓋所有膜面。室溫保溫 5 分鐘左右，在此過(guò)程中請仔細觀(guān)察信號的出現。注意：如果信號強，在暗室中能很快看到陽(yáng)性信號出現。
3．3. 待信號出現且穩定后，用鑷子夾起膜，除去多余的顯色液，平放在干凈的保鮮膜上，膜的正面（蛋白質(zhì)面）朝上，在轉移膜的上面再覆蓋一層保鮮膜，除去保鮮膜與轉移膜之間的空氣泡，請務(wù)必保證保鮮膜是干凈的，不被其他雜物或液體污染。
4．4. 在暗室中，將膜的正面對著(zhù) X-光片，放入暗盒。第一次曝光時(shí)間在 1 分鐘左右(有經(jīng)驗的操作者可以根據信號的強弱自行決定)，立即按要求對 X-光片進(jìn)行顯影和定影，確定最佳曝光時(shí)間。曝光時(shí)間從數秒到數小時(shí)不等；特別弱的過(guò)夜曝光也可。
注意
1.PVDF 膜較硝酸纖維膜能更好的結合蛋白，因此呈現較強的信號。選高質(zhì)量的 PVDF 膜；盡可能不用 Nylon 膜。
2.2.與抗體結合以后，要保證膜處于濕潤狀態(tài)，否則會(huì )導致背景較高。
3.3.沒(méi)有信號的原因：有些抗體不識別變性抗原，有時(shí)需要考慮電泳過(guò)程對蛋白質(zhì)結構的影響；樣品中無(wú)待測蛋白質(zhì)或含量過(guò)低；一抗效價(jià)低，用量少，可適當增加一抗的用量；
4.4.背景過(guò)高原因：轉移膜封閉不充分；與抗體孵育后洗滌；膜在處理過(guò)程中過(guò)干；二抗用量過(guò)多等。
5.5.注意及時(shí)更換顯影液、定影液。

PCR基本步驟及注意事項？

一、實(shí)驗原理

PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法，它類(lèi)似于生物體內DNA的復制。在生物體內DNA復制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而體外PCR反應同樣需要類(lèi)似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設計的特定序列，實(shí)現對特定位置的擴增；PCR Buffer提供一個(gè)反應的緩沖環(huán)境；反應過(guò)程同生物體內一樣，DNA雙鏈打開(kāi)，引物結合模板，延伸形成新鏈。而這些過(guò)程在生物體內靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過(guò)控制反應溫度實(shí)現的。如常用94℃變性模板DNA打開(kāi)雙鏈，在退火溫度處引物結合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反復重復此過(guò)程即可實(shí)現對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環(huán)開(kāi)始才產(chǎn)生出和靶DNA區段相同的DNA分子，進(jìn)一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區段的指數加倍。

在擴增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來(lái)呈指數擴增的反應變成平坦的曲線(xiàn),產(chǎn)物不再隨循環(huán)數而明顯上升,這稱(chēng)為平臺效應。平臺期(Plateau)會(huì )使原先由于錯配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續大量擴增，達到較高水平。因此，應適當調節循環(huán)次數，在平臺期前結束反應， 減少非特異性產(chǎn)物。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式，主要包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產(chǎn)物，cDNA等，但不能為RNA。對于不同類(lèi)型的模板，其主要不同在于預變性的時(shí)間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預變性時(shí)間10min足夠，質(zhì)粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min、PCR產(chǎn)物預變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板，只不過(guò)在第一輪循環(huán)時(shí)只有一個(gè)引物結合，合成另一條鏈。從第二輪開(kāi)始，兩個(gè)引物均與特異位點(diǎn)結合，從而實(shí)現了與常規PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進(jìn)行PCR擴增，原因就在于實(shí)現PCR反應的是DNA聚合酶，只能特意識別DNA鏈。

2.對于模版的量來(lái)說(shuō)，一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結構比較復雜，提取的濃度也往往比較大，為防止濃度過(guò)大對PCR造成影響，故需對提取的DNA進(jìn)行梯度稀釋。否則濃度過(guò)高則可能會(huì )引起非特異性擴增。對于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結構簡(jiǎn)單，且提取濃度一般較低，則無(wú)需稀釋。

PCR實(shí)驗中應該注意的問(wèn)題有哪些?

沒(méi)有ct值

檢測結果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問(wèn)題:

1、循環(huán)數不夠(一般不超過(guò)45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準);

2、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時(shí)采集,TaqMan法則一般在退火結束時(shí)或延伸時(shí)采集信號,另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解?？赏ㄟ^(guò)PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過(guò)500ng,根據試劑盒說(shuō)明書(shū)即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應考慮樣本準備中雜質(zhì)的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過(guò)4℃以上也會(huì )影響擴增)。

ct值過(guò)晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數的樣品,Ct值會(huì )增大, 但是一般不宜超過(guò)40循環(huán), 否則定量不準確。

因此,判斷Ct值出現過(guò)晚是否屬于非正常情況, 需要根據具體實(shí)驗設計和目的進(jìn)行。

1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進(jìn)行優(yōu)化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;

2、PCR程序不合適, 改用三步法進(jìn)行反應, 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時(shí)間短(可以在推薦的時(shí)間條件下延長(cháng)10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產(chǎn)物太長(cháng)。PCR產(chǎn)物設計超過(guò)500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進(jìn)行PCR檢測或將模板進(jìn)行稀釋。

公司正在出售的產(chǎn)品：